當您剛畢業(yè)并進入工作時，與一堆名詞面對的實時定量PCR實驗接觸，您是否對從哪里開始感到困惑？ 放大曲線，標準曲線，閾值，CT值，熔解曲線和基線的含義是什么？ 那些實驗的熒光圖像太亮了，但我似乎無法識別它們。 今天，我們將帶您分兩個部分學習這些知識和概念：專業(yè)術語和常見問題。

第一部分專業(yè)條款

1.擴增曲線

放大曲線是指曲線，其中循環(huán)數(shù)為橫坐標和反應期間的實時熒光強度為PCR過程中的縱坐標。

2.基線

基線指的是，在PCR擴增反應的前幾個周期中，熒光信號幾乎沒有變化。 信號級別顯示接近直線，這種直線是基線。

3.熒光閾值設置

通常，PCR反應的前15個周期的熒光信號用作熒光背景信號，熒光閾值是PCR 3-15個周期期間熒光信號的標準偏差的10倍，并設置了熒光閾值 在PCR擴增的指數(shù)階段。 通常，每個儀器在使用前都有其熒光閾值。

4. CT值

CT值表示當熒光信號達到設定閾值時，每個PCR反應管都會發(fā)生的循環(huán)數(shù)。 從研究中，我們知道每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)之間存在線性關系。 初始副本編號越多，CT值越小，反之亦然。 使用具有已知起始副本編號的標準，可以制作校準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，而縱坐標表示CT值。 因此，只要獲得未知樣品的CT值，就可以從標準曲線中計算樣品的初始拷貝數(shù)。

知道更多

有幾個指標可以判斷放大曲線是否良好：

答：曲線的拐點很明顯，尤其是低重分樣品的指數(shù)相很明顯，放大曲線的總體平行性很好，基線是平坦的，沒有上升現(xiàn)象，并且低 - 級的指數(shù)相位 濃度樣品放大曲線很明顯。

B：曲線指數(shù)相的斜率與擴增效率成正比，斜率越大，放大效率越高。

C：標準的基線是平坦或略微降低的，沒有明顯的向上趨勢。

D：每個管的擴增曲線的并行性很好，表明每個反應管的擴增效率相似。

5.熔化曲線
當PCR產物加熱時，隨著溫度的升高，雙鏈擴增產物逐漸解離，從而導致熒光強度降低。 當達到一定溫度時，大量產品分離，導致熒光急劇降低。 使用此功能以及不同PCR產物的不同TM值使熒光信號迅速下降的溫度也不同，這可能是識別PCR特異性的好方法。
6.熔化曲線（采用對數(shù)曲線）
以熔解曲線的對數(shù)形成峰值圖，以更直觀地顯示產品片段的情況。 由于熔化溫度是DNA片段的TM值，因此可以確定某些影響DNA片段TM值的參數(shù)，例如片段大小，GC含量等。通常，根據我們的底漆設計原理，通常會說 放大產物的長度在80-300bp的范圍內，熔化溫度應在80°C和90°C之間。
答：如果在80°C和90°C之間只有一個主峰，則意味著熒光定量PCR是完美的。
B：如果主峰出現(xiàn)在80°C和90°C之間，并且雜質峰出現(xiàn)在80°C以下，則基本上考慮了引物二聚體。 這是一個不錯的選擇，試圖提高退火溫度解決。
C：如果主峰出現(xiàn)在80°C和90°C之間，并且當溫度升高時出現(xiàn)流浪峰，則基本上考慮了DNA污染。 并且需要在實驗的初始階段去除DNA。
7.標準曲線線
將標準標準稀釋至不同的濃度，并用作PCR反應的模板。 標準曲線以標準拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，將測量的CT值作為縱坐標繪制。 量化未知樣品時，可以根據未知樣品的CT值從標準曲線獲得樣品的拷貝數(shù)。 標準曲線對于絕對定量非常重要。

第二部分。 常見問題

Q1：RT-PCR，QPCR，實時PCR和實時RT-PCR有什么區(qū)別？

A1：RT-PCR是逆轉錄PCR，它是聚合酶鏈反應的廣泛使用的變體。 在RT-PCR中，將RNA鏈反轉錄為互補DNA，然后用作PCR通過PCR擴增DNA的模板。

實時PCR和QPCR是同一件事，兩者都是實時定量PCR，這意味著PCR過程中的每個周期都有數(shù)據的實時記錄。 這樣，可以精確分析啟動模板的數(shù)量。

盡管實時PCR和逆轉錄PCR似乎都可以縮寫為RT-PCR，但國際公約是RT-PCR專門指的是逆轉錄PCR，而實時PCR通常被縮寫為qPCR（量化實際真實的真實真實真實的真實PCR）  - 時間PCR）。

實時RT-PCR（RT-QPCR）是一種逆轉錄PCR，結合了熒光定量技術：從RNA到獲得cDNA（RT）的首次逆轉錄，然后使用實時PCR進行定量分析（QPCR）。

Q2：為什么在80-300bp的范圍內控制熒光定量PCR的放大產物片段的長度？

A2：每個基因序列的長度不同，其中一些是幾個Kb和幾百個BP。 但是，當我們設計底漆時，我們只需要要求產品的長度為80-300bp，而太短或太長不適合定量PCR檢測。

產品片段太短，無法與引物二聚體區(qū)分開。 引物二聚體的長度約為30-40bp，當它小于80bp時，很難區(qū)分它是引物二聚體還是產品。 如果產品片段太長，超過300bp，這很容易導致放大效率較低，并且無法有效檢測基因的量。

例如，當您計算教室里的人數(shù)時，您只需要計算有多少個嘴巴即可。 檢測基因時也是如此。 您只需要檢測一個基因的某個序列即可表示整個序列。 如果您既計算嘴巴的數(shù)量，又要計算鼻子，耳朵和眼鏡的數(shù)量以計算人數(shù)，那么犯錯很容易。

Q3：底漆設計的最佳長度是多少？

A3：一般而言，20-24bp范圍內的底漆長度很好。 當然，我們必須在設計底漆時注意底漆TM值，因為它與最佳退火溫度有關。 經過大量實驗，已經證明60℃是一個很好的TM值。 低退火溫度很容易導致非特異性擴增，而高退火溫度通常會導致放大效率低，放大曲線的晚期峰和延遲的CT值。

問題4：收集的樣品量會影響實驗結果嗎？

A4：不。顯然，收集的樣品越多，提取的RNA越多，cDNA越多，目標片段就會越多。 對于絕對定量，要計算目標片段的拷貝數(shù)，收集的樣品量肯定會影響實驗結果。 例如，檢測血液中丙型肝炎病毒HBV的是以一定量（1ml）的血液檢測HBV含量。

對于科學研究中通常使用的相對定量，樣品的數(shù)量與實驗結果無關，因為相對定量是指靶基因與參考基因之間的比較。 只是請認為它們是同一核酸鏈中存在的上游和下游片段。 如果樣本量很大，則參考基因和靶基因均以同等比例同時增加，這不會影響結果。

Q5：逆轉錄酶的效率會影響實驗結果嗎？

A5：與上面相同。 請注意，我們希望獲得更高的逆轉錄效率，但是我們更渴望逆轉錄酶的逆轉錄效率相對穩(wěn)定并獲得均勻的結果。 這將是對主要公司逆轉錄套件的優(yōu)化功能的測試。

問題6：TAQ酶的效率會影響實驗結果嗎？

A6：TAQ酶的效率相對較大。 通常，需要熱啟動的taq酶，并且效率相對較高。 對于商業(yè)熒光定量試劑盒，每個制造商將根據自己的產品接近100％的產品來優(yōu)化最佳狀態(tài)的效率，如果效率太低，則無法獲得實驗結果。 對于不同公司的產品，這是質量的衡量標準。

問題7：熒光染料的量會影響實驗結果嗎？

A7：是的，會。 如果熒光染料太飽和，則會引起某些儀器的噪聲干擾。 如果熒光染料未飽和，并且熒光值太低，則它將盡早進入高原相，并且放大曲線將是平坦的。 在熒光定量實驗中，主要看到CT值，因此對于晚期擴增曲線而言，進入高原階段并不重要，但是該圖不夠美麗。 如果您必須做出選擇，則首先選擇熒光染料稍微不飽和。 但是，當使用同一公司的同一產品時，其效果基本上可以忽略不計。

問題8：PCR管的透射會影響實驗結果嗎？

A8：是的。 但是，對于來自同一制造商的同一批消耗品，可以忽略這種效果。 這是一個不錯的選擇，最好使用帶有高滲透性膜的96孔板來最大程度地減少消耗品的光透射率的影響。

Q9：操作期間的誤差會影響實驗結果嗎？

A9：操作過程的影響主要反映在均勻性中。 均勻性意味著系統(tǒng)中的所有組件均勻混合在一起，瞬時離心可以解決此問題。 此外，對于初學者，最好將PCR系統(tǒng)調整為20英寸以上，而一個太小的系統(tǒng)更容易出現(xiàn)錯誤。 如果正確優(yōu)化退火溫度，則底漆濃度對CT的影響最小化。 而且您會知道，可以通過優(yōu)化退火溫度來避免一些操作錯誤（例如底漆濃度）。

總結

以上是新手在實驗期間經常遇到的一些問題和疑問，我們希望這些問題可以幫助您解決一些困惑。 實驗是產生混亂和解決問題的過程，希望您能從中得到一些東西。 感謝您的閱讀，我們下次會見您！